İnsanlarda , sindirilmiş proteinlerin,yapılarındaki amino asitlere parçalanması gastrointestinal sistem içinde gerçeklesir.Diyet proteinin mideye girmesi gastrik mukozayı stimüle ederek gastrin hormonu sargılar,bu da gastrik bezlerin ana hücrelerinden pepsinojen ve parietal hücrelerden hidroklorik asit salınımını stimüle eder.Asidik mide suyu (pH 1,0-2,5) hem çoğu bakterileri ve diğer yabancı hücreleri öldüren bir antiseptik,hemde globuler proteinlerin yapısını açan ve onların internal peptid bağlarının enzimatik hidrolize daha uygun hale gelmesini sağlayan denaturasyon ajanıdır.İnaktif bir prekürsör veya zimojen olan pepsinojen,pepsinin kendi enzimatik aktivasyonuyla aktif pepsine dönüştürülür. Bu proseste polipeptid zincirinin amino terminal kısmından 42 amino asit kalıntısı uzaklaştırılır,kalan kısım pepsindir.Midede pepsin,sindirilen proteinlerin amino terminal kısmının Phe ,Trp ve Try aromatik amino asitlerinin peptid bağlarını hidroliz ederek uzun polipeptid zincirlerini daha küçük peptid karışımlarına parçalar.

Asidik mide içeriği ince bağırsağa geçince,düşük pH sekretin hormonunun kana salınımını tetikler.Sekretin pankreastan ince bağırsağa bikarbonat salımını stimüle eder,gastrik HCl nötralize olur,aniden pH 7 civarına yükselir.(Tüm pankreas sekresyonu pankreatik kanallarla ince bağırsağa geçer.)Proteinlerin sindirimi ince barsakta devam eder. Amino asitlerin bağırsağın üst kısmına (duodenum )ulaşması,optimum aktivite pH’sı 7-8 olan birkaç pankreatik anziminin salınımını stimüle eden kolesistokinin hormonunun kana salınımına neden olur.Tripsin ,kimotripsin,karboksipeptidaz A ve Bnin zimojenleri olan tripsinojen ,kimotripsinojen ,prokarboksipeptidaz Ave B pankreasın egzokrin hücreleri tarafından sentezlenir ve salgılanır.Tripsinojen aktif formu olan tripsine bağırsak hücrelerinden salınan proteolitik bir enzim olan enteropeptidaz A tarafından çevrilir.Serbest tripsin ,ilave tripsinojenin tripsine dönüşünü kataliz eder.Tripsin aynı zamanda kimotripsinojen ,prokarboksipeptidaz ve proeelastazı da aktive eder.

Pepsin,tripsin ve kimotripsin farklı amino asitlere spesifik olduğundan protein sindiriminin bu basamağı çok başarılı etki gösterir.TripsinLys ve Arg artıklarının katıldığı karbonil gruplarının peptid bağlarını hidroliz eder,kimotripsin Phe, Trp ve Try artıklarının karboksi terminal kısmının peptid bağlarını hidrolizler

İnce bağırsakta kısa peptidlerin yıkımı şimdi diğer intestinal peptidazlar tarafından tamamlanır.Bunlar peptidlerden karboksi terminal artıkları ardarda koparan , karboksipeptidaz Ave B ile kısa peptidlerden amino terminal artıları ardarda hidroliz eden aminopeptidaz’ dır.Bu proteolitik enzim ve peptidazların sıralı aktivasyonları ince bağırsak epitel hücrelerinin içine transport edilebilecek bir serbest aminoasid karışımı sağlar.Serbest aminoasidler villuslardaki kan kaplillerine girer ve karaciğere ulaşır.

Tamamı için tıklayınız

PROTEİNLERİN İZOLASYONU

Hücre içerisinde bulunan proteinler karakterize edilmeden önce hücrenin dışına, bir sıvı içerisine çıkarılmalıdırlar. Bu sıvı genellikle bir tampon olup proteinlerin fizyolojik özelliklerini koruyabilecekleri bir fiziksel ortam oluşturur. Proteinleri hücre içerisinde tutan hücre zarının kırılmasından sonra oluşan protein ve nükleik asit çözeltisine hücreden arındırılmış lizat (cell-free lysate, CFL) adı verilir. CFL hazırlamak için iki temel metottan faydalanılır.
1. Mekanik lizis
Hücre fiziksel bir güç uygulanarak parçalanır. Bu işlemi yapmak için değişik aletlerden faydalanabilinir. Eğer ökaryotik hücreler ile çalışıyorsak grinderler veya elektrikli blanderları kullanmak uygundur. Eğer bakteri hücreleri ile çalışıyorsak Sonikatörler veya French Press adı verilen enstrümanlardan faydalanılmalıdır. Þeçilecek metod hücrenin elde edildiği kaynağa ve kullanılmak istenen metodun sertlik derecesine göre ayarlanır. Mesela eğer dokudan protein elde etmek isteniliyorsa, grinder veya elektrikli blanderler kullanılmalı, eğer hücre kültüründen elde edilen hücrelerle çalışılacaksa 14 gauge’lık bir iğneden faydalanılmalıdır. Sonikatörler ve French Press genelde bakteri hücrelerini parçalamak amacı ile kullanılırlar. Sonikatörler ses dalgaları ile hücreleri parçalarken, French Press basınç kullanır.

Devamı için tıklayınız

Deneyin İlkesi
Alkali ortamda bakır iyonu (Cu+2 ) proteinlerdeki peptit bağları ile bir kompleks oluşturur ve Cu+1’ e indirgenir. İndirgenmiş bakır ve proteinlerin yan zincirinde yer alan Tyr, Trp ve Cys aminoasitleri Folin-Fenol reaktifini indirgeyerek renk oluşumuna neden olur olur. Oluşan rengin şiddeti protein konsantrasyonu ile doğru orantılıdır ve 660 nm’de spektrofotometrik olarak ölçülür.

Uygulama Basamakları
1. Örnek ve standart tüplerine 1 mL protein çözeltisi ve standart çözeltiler, kör tüpüne de 1 mL saf su koyulur.
2. Tüm tüplere 3 mL C reaktifi eklendi. (C reaktifi 100:1 oranında A ve B reaktifi karışımından oluşturulur. A reaktifi %2 Na2CO3, % NaOH, % 0.16 Na-tartarat; B reaktifi
ise %4 CuSO4.5H2O’dır.)
3. Oda sıcaklığında 30 dakika bekletilir.
4. Tüm tüplere 300 mikroL Folin-Fenol reaktifi vortekslenerek eklenir.
5. Oda sıcaklığında 45 dakika bekletilir.
6. Absorbanslar 660 nm’de köre karşı okunur.
7. Protein miktarları oluşturulan standart kalibrasyon grafiğinden yararlanarak hesaplanır.

Referans: Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL and Randall RJ. 1951 Protein measurement
with the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry 193: 265-275

İnsan Protein Atlası – Human Protein Atlas

The human protein atlas shows expression and localization of proteins in a large variety of normal human tissues, cancer cells and cell lines with the aid of immunohistochemistry (IHC) images and immunofluorescence (IF) confocal microscopy images.