Düzce Tıp Fakültesi Dergisi 2008; 3:32-38

Son zamanlarda klinik laboratuarlarda PCR-tabanlı moleküler tekniklerin kullanımı artmıştır.
Bununla birlikte, bu tekniklerden yararlanabilmenin ön şartı, hızlı ve verimli DNA izolasyon yöntemlerine gereksinim duyulmasıdır. Bu amaçla manyetik bilye teknolojisini kullanan otomatik DNA izolasyon sistemleri geliştirilmiştir. Ancak manyetik partiküller elüsyon aşamasında DNA çözeltisinden yeterince uzaklaştırılamazsa, bu manyetik bilyeler amplifikasyon reaksiyonunu bozabilmektedir. Bu durum da PCR sensitivitesini azaltmakta veya yalancı negatif PCR sonuçlarına yol açmaktadır. Bu çalışmanın amacı manyetik bilye teknolojisini kullanan bir otomatik DNA izolasyon cihazıyla elde edilen DNA’ların saflık, verimlilik ve PCR-hibridizasyon performanslarını değerlendirmek ve manuel izolasyon yöntemiyle karşılaştırmaktır. EDTA’lı tam kan örneklerinden otomatik DNA izolasyon sistemiyle (QuadroProbe QP10) elde edilen DNA konsantrasyonları 28 – 74 ng/l aralığında ve A260/A280 oranı ortalama 2.5 ± 0.73 idi. PCR-hibridizasyon işlemlerinden elde edilen sonuçlar gösterdi ki QuadroProbe QP10 ile izole edilen DNA çözeltisi, PCR-hibridizasyon reaksiyonlarını inhibe edebilecek herhangi bir materyal içermemektedir. PCR laboratuarlarında EDTA’lı tam kan örneklerinden yüksek kalitede DNA pürifikasyonu için QuadroProbe QP10 izolasyon cihazı kullanılabilir.

DNA İZOLASYONU
İnsan genomik DNA’sı 3x 109 nukleotid uzunluğundadır. Genomik DNA bütün nükleusu bulunan hücrelerde bulunur ve bu hücreler genomik DNA analizleri için kullanılabilir. Örneğin; prenatal tanı için amniyotik sıvıdaki fetal hücrelerden veya koryonik hücrelerde genomik DNA elde edilebilir. Erişkinlerde periferal kandaki lökositler en kolay ulaşılabilen DNA kaynağıdır. EDTA’lı tüplere alınan 10 ml kan yaklaşık olarak 108 beyaz kan hücresi içerir ve bu miktar hücreden elde edilecek genomik DNA pek çok genetik test için yeterlidir. DNA izolasyonu için pek çok metod vardır. Geleneksel izolasyon yöntemlerinin yanında pek çok firma tarafından üretilen DNA izolasyon kitleri DNA izolasyonunda kullanılmaktadır. Ayrıca mRNA kullanarak sentezlenen cDNA’da bir diğer DNA kaynağıdır. DNA degredasyona karşı dayanıklı bir polimerdir ve uygun saklama şartlarında uzun yıllar korunup tekrar tekrar analizlerde kullanılabilir. Tıbbi Biyoloji laboratuarında yaygın olarak kullanılan amonyum asetat yöntemi ile DNA izolasyonu aşağıda açıklanmıştır.
1. EDTA’lı tüpte bulunan 10 ml periferik kan herhangi bir kontaminasyonu önleyecek özenle 50 ml’lik falkon tüpüne aktarılarak üzerine 1:3 oranında eritrosit lizis tamponu eklenir. +4oC’de 20 dakika bekletilip, 1500 rpm’de 10 dakika santrifüj edilir.
2. Örnek santrifüjden alınarak üzerindeki süpernatant atılır. Pellet süspanse edilir ve üzerine 20 ml eritrosit lizis tamponu eklenir. Tekrar 1500 rpm’de 10 dakika santrifüj edilir ve süpernatan atılır.
3. Pelet tamamen süspanse edilip üzerine 500 l SDS (%10’luk), 50l proteinaz K (20mg/ml) ve 9.4 ml WBL (White Blood-Cell Lysis) tamponu eklenerek 56oC’de su banyosunda gece boyu bekletilir.
4. İnkübasyon sonrası üzerine 3700l Amonyum asetat (9.5 M) eklenip iyice karıştırılır.20 dakika +4 oC ve 4500 rpm’de santrifüj edilir.
5. Üst kısımda kalan pellet olmayan temiz sıvı kısım aktarılarak yeni bir falkon tüpe alınır, altta kalan pellet kısmı atılır. Ayrı tüpe aktarılan supernatanın üzerine -20 oC’de beklemekte olan %99’luk etanol’den 20 ml eklenir ve DNA’nın yüzeyde toplanması beklenir.
6. Toplanan DNA pipet yardımıyla alınarak içersine 400l %70 etanol olan bir eppendorf tüpe aktarılır.
7. Maksimum hızda (13.000 rpm) 10 dakika santrifüj edilerek DNA çöktürülür ve süpernatan atılır.
8. Isıtıcı blokta kurutularak DNA üzerinde kalan alkol uzaklaştırılır.
9. Elde edilen DNA’nın miktarına göre 100–300l kadar TE (Tris-EDTA) tamponu eklenir.
10. 56oC’de 1 saat bekletilerek DNA’nın TE tampon içersinde iyice çözülmesi sağlanır.
11. Ağızları iyice kapatılmış olan eppendorf tüpteki stok DNA’lar +4oC’de deneylerde kullanılmak üzere ismlendirilerek muhafaza edilir.

Devamı için tıklayınız