LOWRY Yöntemi ile Protein Ölçümü

LOWRY Yöntemi ile Protein Ölçümü

Deneyin İlkesi
Alkali ortamda bakır iyonu (Cu+2 ) proteinlerdeki peptit bağları ile bir kompleks oluşturur ve Cu+1’ e indirgenir. İndirgenmiş bakır ve proteinlerin yan zincirinde yer alan Tyr, Trp ve Cys aminoasitleri Folin-Fenol reaktifini indirgeyerek renk oluşumuna neden olur olur. Oluşan rengin şiddeti protein konsantrasyonu ile doğru orantılıdır ve 660 nm’de spektrofotometrik olarak ölçülür.

Uygulama Basamakları
1. Örnek ve standart tüplerine 1 mL protein çözeltisi ve standart çözeltiler, kör tüpüne de 1 mL saf su koyulur.
2. Tüm tüplere 3 mL C reaktifi eklendi. (C reaktifi 100:1 oranında A ve B reaktifi karışımından oluşturulur. A reaktifi %2 Na2CO3, % NaOH, % 0.16 Na-tartarat; B reaktifi
ise %4 CuSO4.5H2O’dır.)
3. Oda sıcaklığında 30 dakika bekletilir.
4. Tüm tüplere 300 mikroL Folin-Fenol reaktifi vortekslenerek eklenir.
5. Oda sıcaklığında 45 dakika bekletilir.
6. Absorbanslar 660 nm’de köre karşı okunur.
7. Protein miktarları oluşturulan standart kalibrasyon grafiğinden yararlanarak hesaplanır.

Referans: Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL and Randall RJ. 1951 Protein measurement
with the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry 193: 265-275